استفاده از پروب های الیگونوکلئوتید فلورسنت برای تمایز بین paracoccidioides brasiliensis و paracoccidioides lutzii در فاز مخمر و میسلیال

TDA ، RCT و MMT کار را ایده آل کردند. TDA آزمایشات و تجزیه و تحلیل های اولیه را انجام داد. RCT ، MMT و EB به بررسی نتایج تجربی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک کمک کردند. TDA ، RCT ، MMT و EB در نوشتن ، بررسی ادبیات و بحث در مورد نسخه خطی کمک کردند.

این یک مقاله دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز انتساب Creative Commons توزیع شده است ، که امکان استفاده ، توزیع و تولید مثل نامحدود در هر رسانه را فراهم می کند ، مشروط بر اینکه کار اصلی به درستی ذکر شود.

داده های مرتبط

خلاصه

زمینه

فلورسانس در هیبریداسیون درجا (FISH) همراه با تقویت سیگنال تیرامید (TSA) با استفاده از الیگونوکلئوتیدهای برچسب زده شده با فلوروفورهای غیر رادیواکتیو یک روش امیدوار کننده برای تشخیص و تمایز گونه های قارچی در نمونه های محیطی یا بالینی است که مناسب برای میکروراگانیسم هایی است که مشکل یا حتی غیرممکن هستندبه فرهنگ

هدف، واقعگرایانه

در این مطالعه ، ما با هدف استاندارد سازی یک تکنیک هیبریداسیون درجا برای تمایز بین گونه های بیماری زا paracoccidioides brasiliensis و paracoccidioides lutzii ، با استفاده از کاوشگرهای DNA خاص گونه که هدف قرار دادن فضایی رونویسی داخلی (ITS-1) ژن rRNA است.

مواد و روش ها

فاز مخمر و میسلیوم از هر گونه پاراکوکسییدیوید ، با دو تکنیک مختلف تشخیص/تمایز مورد آزمایش قرار گرفتند: TSA-Fish برای P. brasiliensis با HRP (پراکسیداز ترب کوهی) مرتبط با انتهای پروب 5. و ماهی برای P. lutzii با فلوئوروفور تگزاس Red-X ® همچنین به انتهای پروب 5 مرتبط است. پس از آزمایش پروتکل های مختلف ، روش بهینه شده برای هر دو تکنیک بدون مثبت بودن با سایر قارچ های بیماری زا انجام شد.

یافته ها

آزمایشات در سیلیکو و آزمایشگاهی هیچ واکنشی با کنترل مانند کاندیدا و کریپتوکوک (در سیلیکو) و کپسولاتوم هیستوپلاسما و Aspergillus spp نشان نمی دهد.(درونکشتگاهی). برای هر دو مرحله (میسلی و مخمر) هیبریداسیون درجا نقاطی از هیبریداسیون ، بدون واکنش متقابل بین آنها ، با سیگنال کمتری برای کاوشگر قرمز تگزاس نسبت به پروب HRP-TSA نشان داد. نقاط هیبریداسیون با مواد ژنتیکی مشخص شده با 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مشخص شد ، که در یک فیلتر متفاوت (WU) در میکروسکوپی فلورسنت مشاهده شد.

نتیجه گیری اصلی

نتایج ما نشان داد که ماهی TSA و/یا ماهی برای تشخیص درجا و تمایز گونه های پاراکوکسییدوئیدها مناسب هستند. این رویکرد پتانسیل استفاده آینده در نمونه های بالینی را برای بهبود پیش آگهی بیماران پاراکوکسییدیویدومیکوز دارد.

واژه های کلیدی: پاراکوکسییدیویدومیکوز ، فلورسانس در هیبریداسیون درجا ، تقویت سیگنال تیرامید ، paracoccidioides spp

گونه های پاراکوکسیوئیدها رشد نسبتاً کندی در کشت دارند که انزوای بالینی و محیطی آنها توسط فرهنگ مستقیم دشوار است. بنابراین ، بسیاری از تلاشها بر روی تکنیک های تشخیص مولکولی متمرکز شده است (تئودورو و همکاران 2005 ، Terçarioli و همکاران 2007 ، آرانتس و همکاران 2013) مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و تغییرات آن ، که بیشتر برای paracoccidioides spp استفاده شده استوادتشخیص در چندین نمونه محیطی (خاک ، گیاهان و بافت های حیوانات) (Bagagli et al. 1998 ، Corredor et al. 2005 ، Theodoro et al. 2005 ، Richini-Pereira et al. 2008 ، Taylor 2011 ، Arantes et al. 2013).

از نظر بالینی ، روش آزمایشگاه مرجع برای تشخیص paracoccidioides spp. تجسم مستقیم پاتوژن در بافت یا جداسازی آن در کشت است (Mendes & Shikanai-Yasuda 2003 ، Shikanai-Yasuda و همکاران 2006) ، اما در موارد چند سلولهای قارچی عفونی یا مواد غیر قابل فرهنگ ، تکنیک های مولکولی مانند در تشخیص درجاDNA هدف خاص می تواند یک انتخاب امیدوار کننده باشد (Perlin & Zhao 2009 ، Ampel 2010 ، Koepsell و همکاران 2012 ، Litvintseva و همکاران 2015) برای تشخیص بیماری زیرا مستقیماً در نمونه بیولوژیکی عمل می کند (Nakagome و همکاران 1991 ، Moter & Gobel 2000 ، Liehr 2009). این روش نه تنها برای تحقیقات زیست محیطی گونه های پاراکوکسییدیوئیدها (De Brito 1999 ، Arantes et al. 2016) ، بلکه برای تشخیص آنها در بافت های بیمار نیز چشم انداز جدیدی را باز کرده است. این همچنین ممکن است یک استراتژی جالب عمدتا برای قارچ های غیرقابل توصیف باشد ، مانند Lacazia loboi یکی دیگر از پاتوژن های سیستمیک از خانواده Ajellomycetacea (لاکاز و همکاران 2002).

فلورسانس در هیبریداسیون درجا - فلورسانس در تکنیک هیبریداسیون درجا (FISH) معمولاً با تقویت سیگنال تیرامید (TSA) ، که بر اساس توانایی پراکسیداز (HRP) است ، در حضور غلظت کم H همراه است₂O₂، برای تبدیل تیرامید دارای برچسب در یک بستر حاوی رادیکال های آزاد اکسیده شده بسیار واکنش پذیر که می توانند به صورت کووالانسی به بقایای تیروزین در یا در نزدیکی HRP متصل شوند (آدامز 1992). این روش جایگزینی برای تحقیقات با نمونه های محیطی است ، زیرا به صورت نمایی سیگنال فلورسانس را افزایش می دهد. به عنوان مثال ، این تکنیک در تشخیص یک پناهگاه کاملاً جدید در پادشاهی قارچی ، به نام Cryptomycota مؤثر بود (جونز و همکاران 2011).

هیبریداسیون درجا (ISH) قبلاً برای تشخیص پاراکوکسییدیوید در بیوپسی های خوراکی بیمار انجام شده است و ژن کدگذاری 28S RRNA را با یک کاوشگر 14 نوکلئوتیدی هدف قرار داده است (De Brito 1999). با این حال ، علیرغم نتایج جالب ، در مقایسه با پایگاه داده بزرگ فعلی موجود برای توالی RRNA قارچی ، این کاوشگر نمی تواند بین P. brasiliensis و P. lutzii تمایز قائل شود و همچنین مکمل های ژن 28S را از بسیاری از گونه های قارچی دیگر نشان می دهد. این را می توان با ماهیت محافظه کارانه بالای ژن کدگذاری 28S rRNA توضیح داد (وایت و همکاران 1990). بنابراین ، با وجود حساسیت بالای این کاوشگر ، که هدف آن یک ژن چند کپی است ، ویژگی آن به خطر می افتد.

در این کار ما استفاده از پروب هایی را که هدف آنها ، فضا رونویسی داخلی 1 (ITS1) ، از دنباله کدگذاری RRNA ، چند نسخه و همچنین در ژنوم قارچی متغیر است ، در داخل P. brasiliensis و همچنین در P. حفظ می کنیم. لوتزیویژگی این پروب ها در سیلیکو و آزمایشگاهی ، عمدتا در مرحله مخمر این قارچ ها مورد آزمایش قرار گرفت. ما همچنین استاندارد سازی دقیق پروتکل هیبریداسیون درجا را برای تمایز پاراکوکسیوئیدها در میسلی (ساپروفیت) و همچنین در فاز مخمر (انگلی) شرح دادیم ، که قبلاً با موفقیت برای مطالعات زیست محیطی در توزیع جغرافیایی گونه های پاراکوکسییدیوئیدها استفاده کرده ایم (Arantes et al2016) ، و اکنون پیشنهاد استفاده از هیبریداسیون درجا برای فاز مخمر برای تمایز هر دو پاتوژن به طور مستقیم در نمونه های بالینی.

مواد و روش ها

نمونه های قارچی برای استاندارد سازی ماهی و روشهای ماهی TSA - سه جدا شده P. brasiliensis (T16B1 ، PB192 و T15LN1) و سه P. lutzii (PB01 ، PB66 و PBEE) به عنوان کنترل مثبت برای استاندارد سازی هیبریداسیون و آزمون ویژگی ها (صلیب صلیب) مورد استفاده قرار گرفتند.-بییدیزاسیون بین آن زمان). ایزوله ها از مجموعه قارچ شناسی آزمایشگاه زیست شناسی قارچی (گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی ، انستیتوی زیست شناسی ، UNESP ، بوتوکاتو ، SP) و آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی قارچی (دانشگاه برزیلیا ، UNB ، DF) بدست آمد. این ایزوله ها از نمونه های بالینی (PB192 ، PB01 ، PB66 و PBEE) و آرمادیلو (T16B1 و T15LN1) هستند و قبلاً به عنوان P. brasiliensis یا P. lutzii شناخته شده اند (آرانتس و همکاران 2013).

برای تست ویژگی ، قارچ هیستوپلاسما capsulatum ، aspergillus flavus ، aspergillus fumigatus و trichophyton mentagrophytes (لاکاز و همکاران 2002) با paracoccidioides spp آزمایش می شوند. پروب هاآنها به دلیل داشتن میزان مثبت بالاتری در نمونه های بالینی ، علاوه بر این که تداخل های احتمالی به عنوان پروب های هیبریداسیون در آزمایشگاه های قارچ شناسی و همانطور که قبلاً توضیح داده شد (آرانتس و همکاران 2016) در نمونه های محیطی مورد استفاده قرار گرفتند. قارچ ها در صفحات آگار Sabouraud Petri تا زمان استفاده از آنها در آزمایشات ، با متغیرهای زمان جوجه کشی و دما برای هر جنس و/یا گونه ها نگهداری می شدند.

روشهای ماهی ماهی و ماهی TSA-آماده سازی معرف برای روش TSA-Fish از کیت تجاری TSA PerkinElmer and و از تجزیه و تحلیل نمونه برداری-پروتکل: مطالعه دینامیک-میزبان-میزبان ، باتلاق Nautset (حوضچه نمک و حوضچه آسیاب) و پروتکل شرح داده شده است. بیگلا و همکاران.(2002). به مستعمرات فاز میسلی ، قطعه ای از 4mm 2 برداشته شد و به محلول تثبیت اضافه شد ، برای فاز مخمر ، دو دستگیره کالیبره شده (50 میکرولیتر) به محلول تثبیت کننده اضافه شد. حجم محلول تعمیر مورد استفاده در هر دو مورد 3. 0 میلی لیتر بود.

برای کشتهای قارچی ماهی و ماهی TSA (مخمر و میسلی) در محلول تثبیت (4 ٪ پارفورمالدئید به علاوه 0. 1 متر بافر فسفات) برای نگهداری از ساختار و مواد ژنتیکی آنها غیرفعال شد. دنباله ای از محلول های 50 ٪ ، 80 ٪ و 100 ٪ اتانول برای از بین بردن محلول تثبیت و سلول های دهیدرات برای جذب کاوشگر خلفی در مرحله هیبریداسیون استفاده شد. پس از کم آبی ، 10 میلی لیتر بافر قبل از هیبریداسیون [2. 0 میلی لیتر از H Ultra Pure H₂o4. 0 میلی لیتر از 40 ٪ فرمامید ؛1. 8 میلی لیتر از 5M NaCl ؛200 میکرولیتر از 1M Tris R (pH 7. 5) ؛100 میکرولیتر از 1 ٪ SDS ؛2 میلی لیتر از 10 ٪ عامل مسدود کننده بافر] برای تثبیت و بهبود نفوذپذیری آنها با تفاوت در فشار اسمزی به نمونه ها اضافه شد. پس از این مرحله اول ، سلول ها با پروب های تهیه شده در بافر هیبریداسیون [2. 85 میلی لیتر میلی متر H20 ، هیبرید شدند. 4. 0 میلی لیتر فرمامید دیونیزه شده (40 ٪) ؛1. 8 میلی لیتر NaCl 5m ؛200 میکرولیتر تریس 1M (pH 7. 5) ؛100 میکرولیتر 1 ٪ SDS ؛2. 0 میلی لیتر بافر مسدود کننده 10 ٪] در غلظت نهایی 50 نانوگرم در میکرولیتر. پس از 16-17 ساعت جوجه کشی در دمای 42 درجه سانتیگراد ، اسلایدها با کنترل قارچی با 50 میلی لیتر بافر شستشو شسته شدند [47. 54 میلی لیتر از Hurtra-Cure H₂o460 میکرولیتر از 5M NaCl ، 500 میکرولیتر از 0. 5M EDTA ، 500 میکرولیتر از 1 ٪ SDS و 1 میلی لیتر 1M TRI (pH 7. 5)] برای حذف پروب های اتصال غیر اختصاصی. پس از شستشو ، اسلایدها با 250 میلی لیتر بافر TNT تثبیت شدند [217. 315 میلی لیتر از Hult-pure H₂o25 میلی لیتر از 1 متر تریس (pH 7. 5) ؛7. 5 میلی لیتر از 5M NaCl و 0. 185 میلی لیتر از Tween 20].

پس از تعادل و شستشوی اسلایدها با بافر TNT ، برای پروتکل TSA-Fish ، 30 میکرولیتر از محلول TSA از کیت تجاری (TSA Plus PerkinElmer ®) بر روی هر اسلاید اضافه شد ، که سپس به مدت 30 دقیقه در یک محفظه مرطوب تاریک جوجه کشی شدند. دمای اتاق. سپس ، اسلایدها دوباره شسته شدند و در دمای اتاق خشک شدند و به دنبال افزودن DAPI (4 ، 6-diamidino-2-phenylindole) ، یک رنگ فلورسنت که به DNA متصل می شود ، عمدتا در مناطق A-T. ما از DAPI در آزمایشات میکروسکوپ فلورسانس برای مشاهده مناطق DNA با یکپارچگی ساختارهای سلولی و علامت گذاری مواد ژنتیکی استفاده کردیم و نقاط واقعی هیبریداسیون پروب را نشان می دهیم ، برای تمایز بین نقاط تجمع داخل سلولی پروب ها و هیبریداسیون واقعی یکسان. اسلایدها با یک لغزش پوشش پوشانده شده و در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می شدند. برای روش ماهی ، پس از افزودن بافر TNT ، مراحل برای اسلایدهای ماهی TSA اما بدون افزودن محلول TSA اعمال می شد.

نتایج

در تجزیه و تحلیل سیلیکو - پروب ها برای هدف قرار دادن منطقه 1 RRNA در P. brasiliensis و P. lutzii طراحی شدند. پروب/HRP آن برای P. brasiliensis آن را از P. lutzii به دلیل C/T SNP (پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی) متمایز می کند و پروب/تگزاس قرمز برای P. lutzii آن را از P. brasiliensis به دلیل G/A و متمایز می کند. T/A SNPS. هر دو پروب برای پاراکوکسیوییدها خاص هستند ، بنابراین ، مکمل ITS1 از هیستوپلاسما ، امونسی ، کاندیدا یا کریپتوکوکوس نیست که با تراز توالی نشان داده شده است (شکل 1). تجزیه و تحلیل در سیلیکو پروب های انجام شده در پایگاه داده NCBI با استفاده از ابزار BLASTN هیچ واکنش متقاطع با قارچ های دیگر نشان نداد.

: در ویژگی های کاوشگر سیلیکو برای هیبریداسیون درجا پاراکوکسیویدهای برزیلیسسیس و P. lutzii. توالی های تراز شده از فاصله رونویسی داخلی 1 (ITS1) منطقه rRNA از پاراکوکسیوئیدها ، کپسولاتوم هیستوپلاسما و Emmonsia sp. مورد استفاده در تست های سیلیکو طراحی کاوشگر برای هیبریداسیون درجا از P. brasiliensis و P. lutzii ، به ترتیب با فلوئوروفورها HRP + فلورسئین و تگزاس-قرمز. طراحی پروب های خاص بر اساس واگرایی بین گونه های پاراکوکسییدیوئیدها و بین جنس Paracoccidioides و سایر گونه های Ajellomycetacea (H. capsulatum و Emmonsia spp) و سایر مخمرهای بیماری زا مانند Cryptococcus sp انجام شده است.(Tremellaceae) و کاندیدا spp.(Saccharomycetaceae).

ماهی برای P. lutzii و TSA-Fish برای میسلی و مخمر P. brasiliensis-کاوشگر تگزاس-قرمز ، مخصوص P. lutzii ، با موفقیت با سلولهای میسلیس جدا شده PB01 ، PB66 و جدا شده PBEE (داده های مکمل ، شکل 1A.، C ، E ، G) ، در حالی که پروب HRP مخصوص P. brasiliensis سلول های میسلی Hybridised از T16B1 ، T15LN9 و PB192 (داده های تکمیلی ، شکل 1i ، K ، M ، O). ماده ژنتیکی با DAPI به عنوان کنترل مثبت برای هیبریداسیون هسته ای (داده های تکمیلی ، شکل 1B ، D ، F ، H ، J ، L ، N ، P) برچسب گذاری شد.

به طور مشابه ، گونه های خاص گونه تگزاس-قرمز و هیبریدیز HRP-TSA به مرحله مخمر P. lutzii (شکل 2A-D) و P. brasiliensis (شکل 2E-H). برخی از این تصاویر هیبریداسیون سلولهای مخمر برای P. lutzii (شکل 3A) و P. brasiliensis (شکل 3B) با تصاویر DAPI مربوطه به دست آمده در فیلتر WU ، با استفاده از نرم افزار Image J (Schineider et al. 2012) ادغام شدند (Schineider et al. 2012)تجسم بهتر از نقاط هیبریداسیون در سلولهای مخمر.

: paracoccidioides spp. سلول های مخمر هیبریداسیون توسط ماهی و تکنیک های ماهی TSA..(B ، D) مخمرهای P. lutzii با DAPI برای تجسم مواد ژنتیکی در ساختارهای سلولی رنگ آمیزی شده است..(F ، H) مخمرهای P. brasiliensis با DAPI برای تجسم مواد ژنتیکی در ساختارهای سلولی رنگ آمیزی شده است.(بزرگنمایی 400x و 1000x).

: تصاویر ادغام شده از هیبریداسیون مخمر با پروب های خاص Paracoccidioides Lutzii و P. brasiliensis.(الف) مخمرهای P. lutzii با پروب قرمز تگزاس نشان داده شده توسط نقاط قرمز داخل سلولی (400x).(ب) مخمرهای P. brasiliensis با پروب HRP-TSA نشان داده شده توسط نقاط سبز داخل سلولی (1000x).(الف ، ب) دیوارهای سلولی را می توان با سازه هایی که به رنگ آبی مشخص شده اند ، تجسم کنند.

ویژگی و حساسیت در آزمایشات آزمایشگاهی-هیچ گونه هیبریداسیون متقاطع تگزاس قرمز (در ماهی برای تشخیص P. lutzii استفاده می شود) یا HRP-probe (که در TSA-Fish برای P. brasiliensis استفاده می شود) به P. brasiliensis و P وجود ندارد. به ترتیب جدا شده های لوتزی (شکل 4). در شکل 4A-B ، ما می توانیم فلورسانس طبیعی سلولهای قارچی را در چند نقطه مشاهده کنیم ، به دلیل تجمع پروب ها و/یا فلوروفورها بدون نقاط انتشار سیگنال برای پروب های هیبریدی. همچنین ، هیچ واکنش متقاطع برای هر کاوشگر در برابر H. capsulatum (آرانتس و همکاران 2016) یا قارچ های دیگر آزمایش شده ، مانند Aspergillus flavus ، A. fumigatus و dermatophyte T. mentagrophytes مشاهده نشده است (داده های مکمل ، شکل 2)وادبیست و چهار اسلاید برای این آزمایش (شش برای هر جدا شده) تهیه شد ، و پس از مشاهده تحت میکروسکوپ فلورسانس ، هیچ ترکیبی برای هر کاوشگر مشاهده نشد ، و ویژگی آنها را برای پاراکوکسییدیوید ها نشان داد. کشفبا این حال ، حفظ پروب قرمز تگزاس در سلولهای Hyphae در یک اسلاید واحد A. flavus (داده های تکمیلی ، شکل 2) تشخیص داده شد.

: آزمایش هیبریداسیون متقابل HRP و پروب های قرمز تگزاس در برابر پاراکوکسیوید لوتزی و. P. brasiliensis.(الف) P. lutzii Isolate PB01 (400x) ، که توسط تکنیک TSA-Fish در معرض پروب HRP خود قرار گرفته است. هیچ ترکیبی مشاهده نشد.(ب) P. brasiliensis Isolate T16B1 (400x) ، که با تکنیک ماهی در معرض کاوشگر قرمز تگزاس قرار گرفته است. هیچ ترکیبی مشاهده نشد. برای هر دو ایزوله مواد ژنتیکی با DAPI (آبی) تحت فیلتر WU در میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد.

بحث

در این مطالعه پروتکل های موجود شرح داده شده در ادبیات و کیت های تجاری به منظور استفاده از پروب های الیگونوکلئوتیدهای دارای برچسب HRP و Texas-RED برای شناسایی پاراکوکسیوئید ها. سلول ها در مرحله میسلی ، همانطور که قبلاً توضیح داده شد (آرانتس و همکاران 2016) و به طور عمده در فاز مخمر ، به عنوان یک رویکرد جدید.

در طی بهینه سازی ماهی (با کاوشگر قرمز تگزاس) و تکنیک های TSA-FISH (با پروب HRP-Fluorescein) ، یک پروتکل نهایی برای تمایز رضایت بخش بین گونه های پاراکوکسییدوئیدها سازگار شد. هر دو پروب به اهداف خود هیبرید شدند و هیچ واکنش متقاطع در جنس و بین paracoccidioides spp نشان ندادند. و سایر گونه های قارچی با توجه به Silico و تجزیه و تحلیل آزمایشگاهی انجام شده است. برای آزمون ویژگی پروب در برابر سایر قارچ ها (داده های تکمیلی ، شکل 2) ، ما برخی از نقاط سیگنال پروب را که در نظر گرفته شده است ، که نقاط تجمع پروب ها در نظر گرفته شده اند ، عمدتاً به دلیل عدم تحمل پروب های ترکیبی در مراحل شستشو در مراحل شستشو تجسم کردیم. سلولهای قارچی ، که به دلیل مواد غیر ژنتیکی رنگ آمیزی شده با DAPI در داخل این سلول ، هنگام مشاهده با فیلتر WU ، تأیید شدند. بنابراین ، ما این نتیجه را به حفظ کاوشگر تبلور ، حتی پس از مراحل شستشو که به دنبال هیبریداسیون است ، نسبت دادیم. بنابراین ، هر دو پروب آزمایش شده خاص و مناسب برای تشخیص قارچی در نظر گرفته شدند.

سیگنال ساطع شده توسط HRP برچسب (P. brasiliensis) بالاتر از سیگنال پروب با برچسب قرمز تگزاس (P. lutzii) بود زیرا تکنیک-ماهی TSA پس از افزودن فلوئورسئین در مرحله نهایی ، انتشار سیگنال پروب های هیبریدی شده را به طور قابل توجهی افزایش می دهدTSA (اسپیل و همکاران 1999 ، کوبوتا و همکاران 2006). با وجود این تفاوت سیگنال ، فقط استفاده از تکنیک ماهی با استفاده از یک کاوشگر برچسب زده شده با تگزاس قرمز ، انتشار سیگنال رضایت بخش از ساختارهای قارچی هیبریدی را نشان داد. با این حال ، بروز فلورسانس اندازه گیری و تفسیر دشوار است. این بستگی به تجربه ناظر دارد که برای شناسایی سلولهای هدف هیبرید شده نیاز به زمان و فداکاری دارد. در آزمایش ما ، ما برای مدت طولانی پس از هیبریداسیون اسلایدها را تجسم نکردیم زیرا از هیچ راه حل تثبیت نشده استفاده نشده است. بنابراین ، ما استفاده از هر معرف ضد محو را برای تجزیه و تحلیل میکروسکوپی طولانی تر در چنین مواردی نشان می دهیم (لانگین و همکاران 1993 ، وو و لوو 2006 ، فوکت و همکاران 2015).

تکنیک هیبریداسیون درجا نشان داد که جایگزینی برای تشخیص مولکولی گونه های پاراکوکسییدیوئیدها توسط PCR و انواع آن مانند PCR تو در تو است. علاوه بر این ، این تکنیک همچنین بین P. brasiliensis و P. lutzii متمایز است. در حقیقت ، تکنیک ماهی ماهی یا TSA که در اینجا اجرا شده است با موفقیت برای تشخیص P. brasiliensis و P. lutzii در آرمادیلو Burrows استفاده شده است ، همانطور که در مطالعه اخیر ما نشان داده شده است (آرانتس و همکاران 2016). علاوه بر این ، تشخیص و تمایز P. brasiliensis و P. lutzii ، به طور مستقیم در نمونه مورد تجزیه و تحلیل ، تکنیک هیبریداسیون درجا را به یک ابزار بالقوه برای تشخیص بالینی نیز تبدیل می کند. علاوه بر ویژگی عالی ، این رویکرد مرجع استاندارد تشخیصی کلاسیک را برای هر میکوز ، که شامل نمایش عامل قارچی در نمونه بیولوژیکی است ، حفظ می کند. علاوه بر این ، همچنین پتانسیل نظارت بر تکامل بالینی پاراکوکسییدیویدومیکوز ، و همچنین برای کمک به تحقیقات در مورد تفاوتهای پاسخ بالینی و ضد قارچ بین P. brasiliensis و P. lutzii در هنگام عفونت دارد.

سپاسگزاریها

به همه گروه های تحقیقاتی که به طور مستقیم یا غیرمستقیم در این مطالعه شرکت کرده اند.

پانویسها و منابع

پشتیبانی مالی: FAPESP (Grant Nº 2012/03233-3 و 2012/14047-6) ، Capes.

منابع

• آدامز جی سی. تقویت بیوتین سیگنال های پراکسیداز بیوتین و ترب کوهی در لکه های هیستوشیمیایی. J Histochem سیتوشم. 1992 ؛40 (10): 1457 1463.[PubMed] [Google Scholar]
• Altschul SF ، Gish W ، Miller W ، Myers EW ، Lipman DJ. ابزار اصلی جستجوی تراز محلی. J Mol Biol. 1990 ؛215 (3): 403-410.[PubMed] [Google Scholar]
• Ampel NM. تشخیص کوکسیدیویدومیکوز. 2 F1000 Med Rep. 2010 ؛2 [مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Arantes TD ، Theodoro RC ، Macoris SAG ، Bagagli E. تشخیص Paracoccidioides sp. در نمونه های آئروسل محیطی. Med Mycol2013 ؛51 (1): 83-92.[PubMed] [Google Scholar]
• Arantes TD ، Theodoro RC ، Teixeira MM ، Bosco SMG ، Bagagli E. نقشه برداری محیطی از پاراکوکسیویدها. در برزیل سرنخ های جدیدی را برای تنوع ژنتیکی ، بیوگرافی و ارتباط میزبان وحشی نشان می دهد. PLOS Need Trop Dis. 2016 ؛10 (4): E0004606.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bagagli E ، Sano A ، Coelho KL ، Alquati S ، Miyaji M ، de Camargo ZP ، et al. جداسازی paracoccidioides brasiliensis از Armadillos (Dasypus novemcinctus) اسیر شده در یک منطقه بومی پاراکوکسییدیویدومیکوز. Am J Trop Med Hyg. 1998 ؛58 (4): 505-512.[PubMed] [Google Scholar]
• Biegala IC ، Keaway G ، Alverca E ، Leon JF ، Vaulot D ، Simon N. شناسایی باکتری های مرتبط با Dinoflagellates (Dinophyceae) Alexandrium spp. با استفاده از تقویت سیگنال تیرامید در هیبریداسیون درجا و میکروسکوپ کانفوکال. J Phycol. 2002 ؛38 (2): 404-411.[Google Scholar]
• Corredor GG ، Peralta LA ، Castaño JH ، Zuluaga JS ، Henao B ، Arango M ، et al. کابینس کابوس آرمادیلو با دم برهنه (میلر 1899): میزبان جدیدی برای paracoccidioides brasiliensis. شناسایی مولکولی جدا شده. Med Mycol2005 ؛43 (3): 275-2280.[PubMed] [Google Scholar]
• De Brito T. در هیبریداسیون درجا در پاراکوکسیوئیدومیکوز. Med Mycol1999 ؛37 (3): 207 211.[PubMed] [Google Scholar]
• Fouquet C ، Gilles JF ، Heck N ، Dos Santos M ، Schwartzma R ، Caaya V ، et al. بهبود وضوح محوری در میکروسکوپ کانفوکال با رسانه نصب با ضریب شکست بالا. PLOS یکی. 2015 ؛10 (3): E0121096.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• MD Jones ، Fo I ، Gadelha C ، Egan MJ ، Bass D ، Massana R ، et al. کشف اشکال میانی رمان ، درخت قارچی زندگی را دوباره تعریف می کند. طبیعت2011 ؛474 (7350): 200-203.[PubMed] [Google Scholar]
• Koepsell SA ، Hinrichs SH ، Iwen PC. استفاده از یک روش PCR در زمان واقعی برای کپسولاتوم هیستوپلاسما به بافت انسانی تعبیه شده با پارافین فرمالین که از نظر بالینی مرتبط است. J Clin Microbiol. 2012 ؛50 (10): 3395-3397.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kubota K ، Ohashi A ، Imachi H ، Harada H. تجسم mRNA MCR در یک متانوژن توسط فلورسانس در هیبریداسیون درجا با یک پروب الیگونوکلئوتیدی و تقویت سیگنال تیرامید دو پاس (ماهی TSA دو پاس) J روشهای میکروبیول. 2006 ؛66 (3): 521-528.[PubMed] [Google Scholar]
• Lacaz CS ، Porto E ، Martins JEC ، Heins-Vaccari EM ، De Melo NT. Tratado de Micologia Médica Lacaz. سائو پائولو: سارویه ؛2002. [Google Scholar]
• فلورسانس Liehr T. در هیبریداسیون درجا (FISH) - راهنمای برنامه. برلین هایدلبرگ: Springer-Verlag ؛2009. [Google Scholar]
• Litvintseva AP ، Marsden-Haug N ، Hurst S ، Hill H ، Gade L ، Driebe EM ، et al. تب دره: پیدا کردن مکان های جدید برای یک بیماری قدیمی: کوکسیوئیدها ایمیتیت موجود در خاک ایالت واشنگتن مرتبط با عفونت اخیر انسان. Clin Infect Dis. 2015 ؛60 (1): E 1-E3.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Longin A ، Souchier C ، French M ، Bryon PA. مقایسه عوامل ضد پژمرده مورد استفاده در میکروسکوپ فلورسانس: تجزیه و تحلیل تصویر و مطالعه میکروسکوپ کانفوکال لیزر. J Histochem سیتوشم. 1993 ؛41 (12): 1833-1840.[PubMed] [Google Scholar]
• MENDES RP ، MA Shikanai-Yasuda. Cimerman S ، Cimerman B. Medicina Tropic. سائو پائولو: آتنو ؛2003. Paracoccidioidomicose ؛صص 505-545.[Google Scholar]
• Moter A ، Gobel UB. فلورسانس در هیبریداسیون درجا (FISH) برای تجسم مستقیم میکروارگانیسم ها. روشهای میکروبیول. 2000 ؛41 (2): 85 112.[PubMed] [Google Scholar]
• Nakagome Y ، Nagafuchi S ، Seki S ، Nakahori Y ، Tamura T ، Yamada M ، et al. یک واحد تکراری از خانواده Dyz1 در کروموزوم Y انسان از بخش هایی با خاصیت مرد جزئی تشکیل شده است. ژنتیک سلول سیتوژنت. 1991 ؛56 (2): 74-77.[PubMed] [Google Scholar]
• Perlin DS ، Zhao Y. سکوهای تشخیصی مولکولی برای تشخیص آسپرژیلوس. Med Mycol2009 ؛47 (عرضه 1): S223 - S232.[PubMed] [Google Scholar]
• Richini-Pereira VB ، Bosco SM ، Griese J ، Theodoro RC ، Macoris SA ، Da Silva RJ ، et al. تشخیص مولکولی paracoccidioides brasiliensis در حیوانات وحشی کشته شده جاده. Med Mycol2008 ؛46 (1): 35-40.[PubMed] [Google Scholar]
• اشنایدر CA ، Rasband WS ، Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 سال تجزیه و تحلیل تصویر. روشهای NAT. 2012 ؛9 (7): 671-675.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shikanai-Yasuda MA ، Telles FQ ، Filho ، Mendes RP ، Colombo AL ، Moretti ML. رهنمودهای مربوط به پاراکوکسیوئیدومیکوز. Rev Soc Bras Med Trop. 2006 ؛39: 297-310.[PubMed] [Google Scholar]
• SPEEL EJM ، HOPMAN AHN ، KOMMINOTH P. روشهای تقویت برای افزایش حساسیت هیبریداسیون درجا: کارت بازی (ها) J Histochem سیتوشیم. 1999 ؛47 (3): 281 288.[PubMed] [Google Scholar]
• Tamura K ، Stecher G ، Peterson D ، Filipski A ، Kumar S. Mega6: تجزیه و تحلیل ژنتیک تکاملی مولکولی نسخه 6. 0. Mol Biol Evol. 2013 ؛30 (12): 2725 2729.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• تیلور JW. یک قارچ = یک نام: DNA و نامگذاری قارچی بیست سال پس از PCR. قارچ ایما. 2011 ؛2 (2): 113 120.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Teixeira MM ، تئودورو RC ، De Carvalho MJ ، Feandes L ، Paes HC ، Hahn RC ، et al. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک سطح بالایی از زایمان را در جنس پاراکوکسیوئیدها نشان می دهد. مول فیلوژنتیک تحول. 2009 ؛52 (2): 273-2283.[PubMed] [Google Scholar]
• Terçarioli GR ، Bagagli E ، Reis GM ، Theodoro RC ، Bosco SM ، Macoris SA ، et al. مطالعه اکولوژیکی پاراکوکسیوئید های brasiliensis در خاک: توانایی رشد ، تولید کونیدیا و تشخیص مولکولی. 92 میکروبیول BMC. 2007 ؛7 [مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Theodoro RC ، Candeias JM ، Araújo JP ، Jr ، Bosco SM ، Macoris SA ، Padula LO ، et al. تشخیص مولکولی paracoccidioides brasiliensis در خاک. Med Mycol2005 ؛43 (8): 725-729.[PubMed] [Google Scholar]
• Thompson JD ، Higgins DG ، Gibson TJ. Clustal W: بهبود حساسیت تراز توالی چندگانه مترقی از طریق وزن توالی ، مجازات های شکاف خاص موقعیت و انتخاب ماتریس وزن. اسیدهای نوکلئیک Res. 1994 ؛22 (22): 4673-4680.[مقاله رایگان PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• White TJ ، Bruns TD ، Le SB ، Taylor JW. تقویت و توالی مستقیم ژنهای RNA ریبوزومی قارچی برای فیلوژنتیک. در: Iis MA ، Gelfand DH ، Sninsky JJ ، White TJ ، ویراستاران ، سردبیران. پروتکل های PCR: راهنمای روش ها و برنامه ها. سن دیگو: دانشگاهی ؛1990. صص 315-322.[Google Scholar]
• Wu JS ، Luo L. پروتکل برای جدا کردن مغز Drosophila melanogaster برای تصویربرداری زنده یا ایمن سازی. پروتکل NAT2006 ؛1 (4): 2110 2115.[PubMed] [Google Scholar]

مقالاتی از Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz در اینجا ارائه شده است از موسسه موسسه ای از Instituto Oswaldo Cruz