تنظیم رشد مونتاژ دوک نخ ریسی و سیتوکینز در طول جنین زایی مهره دار

تقسیمات سلولی گرا به طور نامتقارن APKC را جدا کرده و تنوع سرنوشت سلولی را در جنین زنوپوس اولیه ایجاد می کند.

• Glotzer M.

]. سیتوکینز توسط اسپیندل مرکزی ، یک ساختار مبتنی بر میکروتوبول که حاوی موتورهای میکروتوبول متعدد و پروتئین های اتصال دهنده میکروتوبول ، از جمله PRC1 است ، کنترل می شود.

• Glotzer M.

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

• Verbrugghe K. J.
• White J. G.

SPD-1 برای تشکیل منطقه میانی دوک نخ ریسی مورد نیاز است اما برای تکمیل سیتوکینز در جنین های C. elegans ضروری نیست.

• ورنی اف.
• Somma M. P.
• Gunsalus K. C.
• Bonaccorsi S.
• Belloni G.
• گلدبرگ M. L.
• گتی م.

]. ما در اینجا نشان می دهیم که مونتاژ و عملکرد اسپیندل مرکزی بین دو جمعیت مرتبط از سلولهای اپیتلیال در توسعه جنین های مهره داران مورد بررسی در داخل بدن به طور چشمگیری متفاوت است. در مقایسه با سلولهای اپیدرمی ، سلولهای اپیتلیال عصبی اولیه تحت جدا شدن کروموزوم آنافاز اغراق آمیز ، خزیدن سریع و کاهش قابل توجه چگالی میکروتوبول در منطقه میانی دوک نخ ریسی قرار می گیرند. سیتوکینز در سلولهای اپیتلیال عصبی اولیه طبیعی به این ترتیب شبیه به سلولهای مهره داران کشت شده است که به طور تجربی از PRC1 تخلیه می شوند [

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• ساودی Y.
• Jablonski S. A.
• Perard J.
• ین T. J.
• مارگولیس R. L.

فرسایش PRC1 توسط RNA تداخل کوچک نشان می دهد که آبسه سیتوکینتیک نیاز به یک بسته اسپندل مرکزی در سلولهای پستانداران دارد ، در حالی که تکمیل خزیدن نیست.

• Kurasawa Y.
• Eashaw W. C.
• Mochizuki Y.
• Dohmae N.
• Todokoro K.

]. ما می دانیم که mRNA ژن PRC1 و بیان پروتئین در جنین های اولیه مهره داران به طور شگفت آور پویا است و سلولهای صفحه عصبی حاوی PRC1 کمتری نسبت به سلولهای اپیدرمی هستند. بیان بیش از حد PRC1 هر دو آنافاز اغراق آمیز و کاهش چگالی میکروتوبول میانی مشاهده شده در سلولهای اپیتلیال عصبی اولیه را بهبود می بخشد. این تغییرات با واسطه PRC1 به مکانیسم سیتوکینتیک ممکن است مربوط به تخصص میانه در سلولهای عصبی باشد [

• Bellairs R.
• Bancroft M.

• Bancroft M.
• Bellairs R.

تمایز صفحه عصبی و لوله عصبی در جنین جوجه جوانمطالعه با میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری

• دوبرویل V.
• Marzesco A. M.
• کوربیل دی.
• هاتنر دبلیو بی.
• ویلش-برانینگر ام.

میانه بدن و مژک اولیه پیش سازهای عصبی، ذرات غشای خارج سلولی غنی شده در نشانگر سلول های بنیادی پرومینین-1 را آزاد می کنند.

• Wilcock A. C.
• Swedlow J. R.
• طبقه K. G.

جهت گیری دوک میتوزی سلول های بنیادی و حالت های انتهایی تولید نورون را در نخاع اولیه متمایز می کند.

• کوهن ای.
• بینه اس.
• ماینینگر وی.

سیلیوژنز و تشکیل سانتریول در سیستم عصبی جنینی موشتحلیل فراساختاری

]. این داده ها نشان می دهد که PRC1 یک تنظیم کننده وابسته به دوز دوک مرکزی در جنین مهره داران است و انعطاف پذیری غیرمنتظره ای را برای مکانیسم های اساسی تقسیم سلولی نشان می دهد.

نتایج و بحث

تغییرات در رفتارهای سلولی اغلب با تغییرات کاملاً تنظیم شده در بیان ژن در جنین های در حال رشد همراه است. برای مثال، بیان الگوی تنظیم کننده های اسکلت سلولی تغییرات هماهنگ شکل سلولی را در طول مورفوژنز لوله عصبی مهره داران کنترل می کند.

• هایگو اس. ال.
• هیلدبراند جی. دی.
• هارلند آر. ام.
• والینگفورد جی. بی.

Shroom باعث انقباض اپیکال می شود و برای تشکیل نقطه لولا در طول بسته شدن لوله عصبی لازم است.

]. جنبه های اساسی تر رفتار سلولی، مانند سیتوکینز، نیز در طول رشد متفاوت است و چنین تغییراتی می تواند پیامدهای رشدی داشته باشد. تقسیم سلولی به طور گسترده در سلول های کشت شده مهره داران و در جنین های مرحله شکافت اولیه مورد مطالعه قرار گرفته است، اما اطلاعات کمی در مورد مکانیسم های اساسی سیتوکینز در جنین های مهره داران بالغ تر وجود دارد.

جنین های قورباغه Xenopus به دلیل رشد بیرونی و اندازه سلولی بسیار بزرگ، دسترسی استثنایی به رفتارهای سلولی مرتبط با جنین زایی مهره داران فراهم می کنند.

• دیویدسون L. A.
• والینگفورد جی. بی.

در: Yuste R. Koerth A. Imaging in Neuroscience and Developement. Cold Spring Harbor Laboratory Press، Cold Spring Harbor، NY 2005

]. ما انتخاب کردیم که از این ویژگی ها برای مقایسه سیتوکینز در دو جمعیت سلول های اپیتلیال سطحی مشتق از اکتودرم استفاده کنیم که هر کدام در تکثیر گسترده ای درگیر هستند. ابتدا، ما صفحه عصبی اولیه را بررسی کردیم، که در نهایت برای تشکیل سیستم عصبی مرکزی توخالی مشخصه حیوانات مهره دار می پیچد.

• والینگفورد جی. بی.

بسته شدن لوله عصبی و نقص لوله عصبی: مطالعات در مدل های حیوانی ناشناخته های شناخته شده و شناخته شده را نشان می دهد.

• ساکا ی.
• اسمیت جی. سی.

• هریس دبلیو.
• هارتنشتاین V.

• گیبسون M. C.
• پاتل A. B.
• Nagpal R.
• پریمون ن.

]. موقعیت سطحی این بافت ها امکان مقایسه با تصویربرداری کانفوکال با وضوح بالا را فراهم می کند (شکل S1 ، بصورت آنلاین). مکانیسم سیتوکینز در بین متازون ها بسیار حفظ می شود و با توجه به اینکه هر دو بافت به صورت اکتودرم به دست می آیند ، ما از دیدن تفاوت های چشمگیر در مکانیسم های سیتوکینتیک بین این دو جمعیت سلولی شگفت زده شدیم.

در داخل بدن تصویربرداری با گذشت زمان از جنین های Xenopus دست نخورده نشان داد که سلولهای موجود در صفحه عصبی اغراق مشخصی از کشیدگی اسپیندل آنافاز را نشان می دهند (آنافاز B). کروموزوم ها در این سلولها از هم جدا شدند تا اینکه کروماتین قشر سلولی را از نزدیک جدا کند (شکل 1A ، براکت ؛ شکل 1C ؛ فیلم S1 ؛ شکل S2B). در مقابل ، در اپیدرم Tailbud ، کروموزومهای آنافاز تقریباً در مرکز هندسی سلولهای دختر جدید متوقف شده اند (شکل 1B ، براکت ؛ شکل 1C ؛ فیلم S2 ؛ شکل S2B) ، الگویی شبیه به بسیاری از سلولهای مهره دار که در فرهنگ تقسیم می شوند.

(A و B) هنوز فریم های گرفته شده از فیلم های تقسیم سلولی در سلولهای اپیدرمی دم بعدی (A) یا در سلولهای اپیتلیال عصبی قبلی (B). غشاها با RFP برچسب گذاری شده اند و کروموزوم ها با H2B-GFP برچسب گذاری می شوند. براکت نشانگر فاصله بین کروموزومها و قشر سلولی است. Arrowhead نشانگر شروع سیتوکینز است. زمان به عنوان حداقل: S در هر صفحه نشان داده شده است. میله های مقیاس 10 میکرومتر را نشان می دهند.

(ج) نمودار نشان دهنده جداسازی کروموزوم در طول آنافاز در سلولهای اولیه عصبی (آبی) و بعداً اپیدرمی (صورتی) به عنوان درصد طول سلول بیان شده است (20 سلول از سه جنین مختلف). اندازه سلول بین این دو جمعیت قابل مقایسه است (شکل S2 را ببینید).

(د) نمودار نشان می دهد پیشرفت از ورود به سیستم خزنده سیتوکینتیک در طول زمان برای سلولهای اولیه عصبی (آبی) و اواخر اپیدرمی (صورتی) (20 سلول از سه جنین مختلف).

(ه) نمودار نشان می دهد میزان فوری ورود به سیستم خزنده سیتوکینتیک در نقاط زمانی در طول سیتوکینز برای سلولهای اولیه عصبی (صورتی) و اواخر اپیدرمی (آبی) (N = 20 سلول از سه جنین مختلف).

(F و G) هنوز قاب هایی که از فیلم هایی که طول عمر اواخر اپیدرم (G) و بافت عصبی اولیه (F) را نشان می دهد ، گرفته شده است. میکروتوبول ها با TAU-GFP برچسب گذاری شده اند و غشاها با غشای RFP برچسب خورده اند. سرهای فلش نشانگر اواسط مدیران است.

(H) نمودار که میانگین طول عمر میانی را برای سلولهای اواخر اپیدرمی (صورتی) و عصبی اولیه (آبی) نشان می دهد (14 سلول عصبی از سه جنین مختلف ؛ 11 سلول اپیدرمی از دو جنین مختلف).

• مشاهده تصویر بزرگ
• دانلود تصویر سلام

این تغییر در میزان آنافاز با تغییر در زمان خزیدن سیتوکینتیک (فیلم های S1 و S2) همراه بود. سلولهای اولیه عصبی و بعداً اپیدرمی از نظر اندازه مشابه هستند و برای تکمیل سیتوکینز تقریباً مشابه دوره های زمانی مشابهی دارند (شکل S2A ؛ شکل 1A و 1B). با این حال ، سیتوکینز در سلولهای اپیدرمی تقریباً 4 دقیقه پس از شروع آنافاز آغاز شد ، اما شروع خندق در سلولهای عصبی به تأخیر افتاد ، تقریباً 6 دقیقه پس از شروع آنافاز آغاز شد (شکل 1A و 1B ، فلش های فلش ؛ شکل 1D). یک انفجار کوتاه از ظهور شتاب از شکاف شکاف در سلولهای عصبی که برای شروع تأخیر سیتوکینز جبران شده است ، و به هر دو جمعیت اجازه می دهد تا حدود 12 دقیقه پس از شروع آنافاز ، خزنده را تکمیل کنند (شکل 1E).

• Glotzer M.

] ، بنابراین ما دینامیک دوک نخ ریسی را در سلولهای اپیدرمی عصبی و صفحه ای و دمبودر بررسی کردیم. با استفاده از TAU-GFP برای تجسم میکروتوبول ها [

• Kwan K. M.
• Kirschner M. W.

Rho-GEF اتصال دهنده میکروتوبول مورفولوژی سلول را در حین گسترش همگرا از Xenopus laevis کنترل می کند.

] در سلولهای اپیدرمی دم ، ما یک توالی معمولی از وقایع را مشاهده کردیم: یک دوک نخ ریخته و غنی از میکروتوبول که باعث ایجاد میانی در سراسر آنافاز و تلوفاز می شود (شکل 2A ، فیلم S3). بعداً در تلوفاز ، میکروتوبول های موجود در منطقه میانی به یک میانه برجسته و غنی از میکروتوبول توسط خزنده سیتوکینتیک وارد شده (شکل 2E ، فلش) فشرده شدند. در طول آنافاز و تلوفاز ، TAU-GFP یک اسپیندل غنی از میکروتوبول آشکار را نشان داد که به طور مداوم مشاهده می شد که در منطقه میانی قرار دارد.

شکل 2 چگالی میکروتوبول را در منطقه میانی دوک نخ ریسی سلولهای اپیتلیال صفحه عصبی در داخل بدن کاهش داد

(A و B) هنوز از فیلم های سلولهای اپیتلیال اپیدرمی در اواخر (A) یا سلولهای اپیتلیال عصبی اولیه (B) فریم شده است که توزیع میکروتوبول های دارای برچسب TAU-GFP را در طول سایتوکاینز نشان می دهد. غشاها با غشای RFP برچسب گذاری شده اند و کروموزوم ها در اواخر اپیدرم با H2B-RFP برچسب گذاری می شوند.

(C-J) ایمونوهیستوشیمی برای α- توبولین در سلولهای اواخر اپیدرمی (C-F) و سلولهای عصبی اولیه (G-J) توزیع های میکروتوبول را که در فیلم های با گذشت زمان دیده می شود ، تأیید می کنند.

• مشاهده تصویر بزرگ
• دانلود تصویر سلام

در مقابل ، تصویربرداری از TAU-GFP در بخش های سلولی عصبی ، کاهش چشمگیر در چگالی میکروتوبول در میانی دوک نخ ریسی در اواخر آنافاز و تلوفاز اولیه را نشان داد (شکل 2B ، فیلم S4). میکروتوبولهای میانی سلولهای عصبی اولیه تقریباً قبل از شروع سیتوکینز از هم جدا شدند و یک منطقه فقیر میکروتوبول را بین پارچه های شکاف ورودی قرار دادند (شکل 2B و 2I ، فلش). با پیشرفت سیتوکینز ، میکروتوبول ها در یا در نزدیکی خزنده ورودی متمرکز شدند. این میکروتوبول ها در اطراف خزنده سیتوکینتیک جمع می شوند ، و فقط در اواخر تلوفز این میکروتوبول ها را برای تشکیل یک میانه (شکل 2B و 2J ، فلش) انجام دادند.

این اختلاف در چگالی میکروتوبول میانی با استفاده از سیستم ایمنی برای α- توبولین تأیید شد (شکل 2C-2J). برای تعیین کمیت این تفاوت ، ما از پارامترهای تصویربرداری یکسان استفاده کردیم و شدت پیکسل را در طول دوک نخ ریسی در سلولهای ایمنی بدن اندازه گیری کردیم ، همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است (خطوط متراکم در پانل های A و B). ما به طور متوسط شدت پیکسل را در دوک های چندین سلول قرار دادیم و داده های گردآوری شده در شکل 3F نشان داده شده است. در سلولهای اپیدرمی Tailbud ، ما یک چگالی مداوم به طور مداوم سیگنال α- توبولین را در طول دوک نخ ریسی مشاهده کردیم ، به جز در مرکز میانی ، که برای آنتی بادی های توبولین غیرقابل دسترسی است [

• Saxton W. M.
• McIntosh J. R.

] (شکل 3F ، خط صورتی). در مقابل ، میانگین چگالی میکروتوبول در سلولهای صفحه عصبی در بیشتر منطقه میانی به طور قابل توجهی پایین تر بود ، اگرچه چگالی در قطب های دوک نخ ریسی با سلولهای اپیدرمی قابل مقایسه بود (شکل 3F ، خط آبی تیره).

(الف) ایمن سازی α- توبولین از یک سلول عصبی در طی اوایل تلوفاز. خط شکسته آبی تیره نشان دهنده موقعیت اسکن خط برای داده های نشان داده شده در (f) است.

(ب) رنگ آمیزی آنتی بادی α- توبولین از یک سلول اپیدرم دم در اوایل تلوفاز. خط شکسته صورتی نشان دهنده موقعیت اسکن خط برای داده های نشان داده شده در (f) است. براکت ها در (b) و (c) فاصله بین کروموزوم ها و قشر سلول را نشان می دهد.

(ج) ایمن سازی α- توبولین از یک سلول عصبی که بیش از حد بیان کننده PRC1-GFP است. خط شکسته آبی روشن نشان دهنده موقعیت اسکن خط برای داده های نشان داده شده در (f) است.

(ه) هنوز از یک فیلم تقسیم در یک سلول اپیتلیال عصبی اولیه GFP مثبت (PRC1).

. سلولهای صفحه ای بیش از حد PRC1-GFP را بیان می کنند (خط آبی روشن ؛ 12 نفر).

(G) نمودار جداسازی کروموزوم آنافاز (به عنوان درصد طول سلول) در سلولهای صفحه عصبی (خط آبی تیره ؛ 12 نفر) ، سلولهای اپیدرمی Tailbud (خط صورتی ؛ N = 20) و سلولهای صفحه عصبی بیش از حد PRC1 را بیان می کنند.(خط آبی روشن ؛ n = 12).

• مشاهده تصویر بزرگ
• دانلود تصویر سلام

بنابراین داده های ما نشان می دهد که سلولهای اپیتلیال اپیدرمی جنینی زنوپوس با سینتیک و مورفولوژی یادآور سلولهای انسانی در کشت تقسیم می شوند. در مقابل ، سلولهای صفحه عصبی جداسازی کروموزوم سریع و اغراق آمیز ، خزنده سریع سیتوکینتیک و کاهش چگالی میکروتوبول در منطقه میانی دوک نخ ریسی را نشان می دهند. این طیف تغییرات در الگوی سیتوکینز مشابه آن است که در سلولهای مشاهده شده به صورت تجربی از پروتئین PRC1 با استفاده از میکروتوبول تخلیه شده است [

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

• Verbrugghe K. J.
• White J. G.

SPD-1 برای تشکیل منطقه میانی دوک نخ ریسی مورد نیاز است اما برای تکمیل سیتوکینز در جنین های C. elegans ضروری نیست.

• ورنی اف.
• Somma M. P.
• Gunsalus K. C.
• Bonaccorsi S.
• Belloni G.
• گلدبرگ M. L.
• گتی م.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• ساودی Y.
• Jablonski S. A.
• Perard J.
• ین T. J.
• مارگولیس R. L.

فرسایش PRC1 توسط RNA تداخل کوچک نشان می دهد که آبسه سیتوکینتیک نیاز به یک بسته اسپندل مرکزی در سلولهای پستانداران دارد ، در حالی که تکمیل خزیدن نیست.

• Kurasawa Y.
• Eashaw W. C.
• Mochizuki Y.
• Dohmae N.
• Todokoro K.

]. این یافته ها این احتمال را نشان می دهد که تفاوت هایی که ما در مکانیسم های تقسیم سلولی بین سلولهای عصبی و اپیدرمی شناسایی کردیم ممکن است توسط PRC1 اداره شود.

بنابراین ما الگوی مکانی مکانی رونویسی PRC1 را با استفاده از هیبریداسیون درجا بررسی کردیم. از آنجا که PRC1 به عنوان یک عنصر سازنده مورد نیاز ماشین آلات سیتوکینز در مهره ها محسوب می شود [

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• ساودی Y.
• Jablonski S. A.
• Perard J.
• ین T. J.
• مارگولیس R. L.

فرسایش PRC1 توسط RNA تداخل کوچک نشان می دهد که آبسه سیتوکینتیک نیاز به یک بسته اسپندل مرکزی در سلولهای پستانداران دارد ، در حالی که تکمیل خزیدن نیست.

• Kurasawa Y.
• Eashaw W. C.
• Mochizuki Y.
• Dohmae N.
• Todokoro K.

] ، ما با تعجب متوجه شدیم که رونویسی PRC1 در جنین ها بسیار پویا است و الگوی بیان به سادگی تکثیر سلولی موازی نیست. در جنین های مرحله عصبی ، ما بیان سطح بسیار کمی mRNA ژن PRC1 را در صفحه عصبی مشاهده کردیم ، اگرچه بیان در سایر مناطق جنین غیر قابل کشف بود (شکل 4A). ما مشاهده کردیم که در مراحل Tailbud mRNA PRC1 در یک الگوی پیچیده بیان شده است ، با بیان سطح بسیار بالا در مغز در حال توسعه ، کلیه ، تابلوی و قوس های شاخه ای و بیان بسیار کم در مناطق دیگر جنین مشاهده می شود (شکل 4B). این تفاوت ها در سطح بیان PRC1 در جنین های نورولا و دمبود در لکه های غربی منعکس شد ، جایی که پروتئین فراوان PRC1 در جنین های تابه تشخیص داده شد اما در نورولا بسیار کمی تشخیص داده شد (نشان داده نشده است).

(الف) هیبریداسیون درجا mRNA ژن PRC1 در یک جنین در مرحله اولیه-مرحله. Arrowheads مرز صفحه عصبی را تشریح می کند.

(ب) هیبریداسیون درجا mRNA ژن PRC1 در جنین در اواخر دم-اپیدرمیس مرحله. سرهای فلش مناطقی از بیان بالای mRNA ژن PRC1 ، از جمله مغز ، کلیه و تابلوی را نشان می دهد.

(ج) ایمن سازی PRC1 در اپیدرم Tailbud. فلش سفید نشان دهنده اسکن خط نشان داده شده توسط خط صورتی در (E) است. Arrowhead قرمز نشان می دهد که یک میانه رنگ آمیزی شده توسط PRC1 است. نوار مقیاس 20 میکرومتر را نشان می دهد.

(د) مصونیت از PRC1 در صفحه عصبی. فلش سفید نشان دهنده اسکن خط است (نشان داده شده توسط خط آبی در (E). فلش قرمز نشان دهنده یک میانه رنگ آمیزی شده توسط PRC1 است. نوار مقیاس 20 میکرومتر را نشان می دهد.

(ه) نمودار اسکنهای خط برای شدت سیگنال PRC1 در سلولهای اپیدرمی Tailbud (صورتی) و سلولهای عصبی صفحه (آبی). فلش و فلش نشان دهنده سیگنال شدید در میانه در هر دو نوع سلول است.

(F) نمودار میانگین شدت پیکسل از اینترفاز ، سیگنال ایمنی سیتوپلاسمی PRC1 برای سلولهای اپیدرم Tailbud (نوار صورتی ؛ N = 12 جنین) و سلولهای صفحه عصبی (نوار آبی ؛ N = 7 جنین).

(G) ایمنی برای PRC1 (سبز) و α- توبولین (قرمز) در یک سلول اپیدرمی دمبود در اوایل تلوفاز. کانال PRC1 به تنهایی در (G ′) نشان داده شده است. PRC1 در اطراف میکروتوبول های بسته بندی شده در منطقه میانی متمرکز است. نوار مقیاس 5 میکرومتر را نشان می دهد.

(ساعت) ایمنی برای PRC1 (سبز) و α- توبولین (قرمز) در یک سلول عصبی در سلول در اوایل تلوفاز. کانال PRC1 به تنهایی در (H ′) نشان داده شده است. با وجود شروع سیتوکینز ، PRC در منطقه میانی متمرکز نیست. نوار مقیاس 5 میکرومتر را نشان می دهد.

(I و J) توسط اواخر تلوفاز ، PRC در هر دو سلول اپیدرمی (I ، I ′) و سلولهای عصبی (J ، J ′) به دوک نخ ریسی بومی سازی می شود.

• مشاهده تصویر بزرگ
• دانلود تصویر سلام

ما در ادامه به دنبال مقایسه سطح پروتئین PRC1 به طور خاص در جمعیت سلول های عصبی-صفح و لوله ای اپیدرمال بودیم. برای این منظور ، ما جنین ها را از یک کلاچ واحد در هر دو مرحله عصبی و زیر بغل جمع آوری کردیم ، و این جنین ها به طور همزمان ایمن شدند و با پارامترهای یکسان با میکروسکوپ کانفوکال تصویربرداری شدند. سطح PRC1 سپس با اندازه گیری شدت پیکسل در امتداد خطوط اندازه گیری شد ، همانطور که توسط فلش های سفید در شکل های 4C و 4D نشان داده شده است. اگرچه سیگنال از کانونهای متمرکز PRC1 در قسمتهای میانی در سلولهای اپیدرمی عصبی و دم قابل مقایسه بود (شکل 4E ، فلش ، فلش) ، سیگنال PRC1 سیتوپلاسمی در سلولهای اینترفاز نسبت به سلولهای اپیدرمی دم به طور مداوم در سلولهای عصبی پایین تر بود (شکل4e). این تفاوت در چندین جنین سازگار بود (شکل 4F). با هم ، داده های هیبریداسیون درجا ، وسترن بلات و ایمن سازی نشان می دهد که سلولهای صفحه عصبی سطح پایین پروتئین PRC1 را نسبت به سلولهای اپیدرمی دم بیان می کنند.

سپس استخدام PRC1 به دوک نخ ریسی را در طول سیتوکینز بررسی کردیم. PRC1 بومی سازی شده به دوک نخ ریسی در طول آنافاز و تلوفاز اولیه در سلولهای اپیدرمی زنوپوس در داخل بدن (شکل 4G و 4G ′) ، همانطور که در سلولهای HeLa کشت مشاهده شده است [

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

]. در مقابل ، ما موارد زیادی از سلولهای صفحه عصبی را پیدا کردیم که در آن سیتوکینز به خوبی در حال انجام بود ، اما در آن PRC1 هنوز در منطقه میانی جمع نشده بود (شکل 4H و 4H ′). در اواخر تلوفاز ، PRC1 در منطقه میانی (شکل 4I و 4J) به طور محکم جمع می شود ، همزمان با تشکیل میکروتوبول های میانی همراه. ما تأخیر مشابهی در استخدام پروتئین با اندیشه میکروتوبول دیگر ، MKLP1 مشاهده کردیم. MKLP1 در منطقه میانی دوک نخ ریسی در اوایل آنافاز در سلولهای اپیدرمی جمع شده است ، اما تا اواخر آنافاز یا تلوفاز اولیه در سلولهای عصبی (شکل S3A و S3B). تأخیر مشابهی در فیلم های با گذشت زمان جنین ها با بیان MKLP1-GFP (فیلم های S7 و S8) مشاهده شد. این تأخیر در استخدام PRC1 و MKLP1 ، هر دو پروتئین با استفاده از میکروتوبول ، با کاهش چگالی میکروتوبول مشاهده شده در منطقه میانی دوک نخ ریسی در این سلول ها سازگار است (شکل 2). با استفاده از ایمن سازی ، ما همچنین مشاهده کردیم که پروتئین های مسافر Aurora B و IncENP هر یک به درستی به محل میانی دوک نخ ریسی از طریق اواسط تا اواخر تلوفاز در هر دو سلول عصبی و سلولهای اپیدرمی Tailbud بومی سازی شدند (شکل S4).

با هم ، داده های ما این احتمال را ایجاد می کنند که کاهش سطح پروتئین PRC1 ممکن است مسئول کشیدگی دوک نخ ریسی و کاهش چگالی میکروتوبول میانی در سلولهای اپیتلیال عصبی اولیه باشد. برای آزمایش این ایده ، ما DNA پلاسمید را به مواد موزائایی بیش از حد PRC1-GFP انسانی در این سلول ها می پردازیم [[

• Vize P. D.
• Melton D. A.
• Hemmati-Brivanlou A.
• هارلند آر. ام.

]. با استفاده از اندازه گیری شدت پیکسل در سراسر دوک شده از جنین های ایمنی ، ما دریافتیم که چگالی میکروتوبول در میانی عموماً میکروتوبول سلولهای عصبی با حضور اضافی PRC1 افزایش یافته است (شکل 3C و 3F). بنابراین ، مشخصات چگالی میکروتوبول در اسپیندل سلولهای صفحه عصبی که به صورت خارج رحمی بیان می کنند ، شبیه به سلولهای اپیدرمی Tailbud است. این اثر خاص برای PRC1 بود ، با توجه به اینکه سایر پروتئین های اتصال دهنده میکروتوبول مانند TAU-GFP این فنوتیپ را استخراج نمی کنند (به عنوان مثال ، شکل 2A).

از آنجا که PRC1 خارج رحمی باعث کاهش چگالی میکروتوبول میانی سلولهای عصبی شده است ، ما بعد از این سؤال پرسیدیم که آیا این تغییر در چگالی میکروتوبول با تغییر در کشیدگی دوک اسپیندل آنافاز مطابقت دارد. در جنین موزاییک ، سلولهای عصبی فاقد GFP با آنافاز اغراق آمیز سلولهای عصبی در جنین های بدون کنترل تقسیم می شوند (شکل 3D و 3G ؛ شکل S2C ؛ فیلم S9). در مقابل ، کشیدگی اسپیندل آنافاز به طور قابل توجهی در سلولهای صفحه عصبی که بیان کننده PRC1-GFP خارج رحمی را کاهش می دهند ، کاهش یافته است (شکل 3E و 3G ؛ شکل S2C). فاصله نهایی جداکننده کروموزومهای دختر در سلولهای عصبی اولیه PRC1-GFP مثبت شبیه به سلولهای اپیدرمی بعدی بود (شکل 3G). PRC1-GFP در طول تلوفاز به دوک نخ ریسی در این سلول ها بومی شده است (شکل 3E ؛ فیلم S10). این داده ها نشان می دهد که تغییر سطح PRC1 می تواند میزان جدایی آنافاز را تغییر دهد. بنابراین ، هر دو جداسازی آنافاز و پروفایل چگالی اسپیندل-میکروتوبول سلولهای عصبی صفحات با بیان خارج رحمی PRC1 به الگوهای شبیه اپیدرم تبدیل می شوند.

سطح بیان از پلاسمیدهای تزریق شده به جنین زنوپوس موزاییک هستند و از سلول به سلول دیگر متغیر هستند [

• Vize P. D.
• Melton D. A.
• Hemmati-Brivanlou A.
• هارلند آر. ام.

]. چگالی میکروتوبول میانی پیشرفته و کاهش جداسازی آنافاز فقط در سلولهای عصبی که بیان سطح کم یا متوسط از PRC1-GFP خارج رحمی مشاهده شد ، مشاهده شد. در سلولهایی که سطح بالاتری از PRC1-GFP را بیان می کنند ، کابل های ضخیم میکروتوبول های برچسب GFP مشاهده شد (شکل S5A ؛ فیلم S11). چنین میکروتوبولهای درون فاز که به طور ناچیزی همراه هستند ، در سلولهای HeLa بیش از حد بیان PRC1 مشاهده می شوند ، اما بسته ها با ورود به آن سلول ها از مرحله M جدا می شوند و تقسیم سلولی طبیعی است [

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

]. در سلولهای عصبی زنوپوس ، چنین بسته های میکروتوبول فقط در سلولهای تقسیم غیر طبیعی مشاهده شد. چنین سلولهایی از سلولهای شاهد بزرگتر بودند و بیشتر آنها چند هسته ای ظاهر می شدند (شکل S5B). با این وجود ، هنگامی که این سلولها وارد فاز M شدند ، کابل های PRC1-GFP جدا شدند (شکل S5C ، S5C ′ و S5C ″ ؛ فیلم S11) ، نشان می دهد که مکانیسم های تنظیم فعالیت وابسته به چرخه سلول PRC1 [[

• جیانگ دبلیو.
• جیمنز جی.
• Wells N. J.
• HOPE T. J.
• WAHL G. M.
• شکارچی T.
• Fukunaga R.

• ژو ج.
• جیانگ دبلیو.

جابجایی وابسته به چرخه سلولی PRC1 بر روی دوک توسط KIF4 برای تشکیل میانی و سیتوکینز ضروری است.

] در سلولهای عصبی اولیه وجود دارد ، اما این سلولهای عصبی نمی توانند به طور عادی در حضور سطح بالای PRC1 تقسیم شوند. با هم ، این نتایج نشان می دهد که سلولهای جنینی زنوپوس نسبت به تغییرات در سطح پروتئین PRC1 بسیار حساس هستند.

PRC1 یک مؤلفه اساسی دوک نخ ریسی است و در اکثر انواع سلول برای سیتوکینز مورد نیاز است [

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• جیانگ دبلیو.
• شونه جی.
• شکارچی T.
• مارگولیس R. L.

PRC1 یک پروتئین اتصال دهنده و بسته بندی میکروتوبول برای حفظ منطقه میانی دوک میتوزی است.

• Verbrugghe K. J.
• White J. G.

SPD-1 برای تشکیل منطقه میانی دوک نخ ریسی مورد نیاز است اما برای تکمیل سیتوکینز در جنین های C. elegans ضروری نیست.

• ورنی اف.
• Somma M. P.
• Gunsalus K. C.
• Bonaccorsi S.
• Belloni G.
• گلدبرگ M. L.
• گتی م.

• Mollinari C.
• Kleman J. P.
• ساودی Y.
• Jablonski S. A.
• Perard J.
• ین T. J.
• مارگولیس R. L.

فرسایش PRC1 توسط RNA تداخل کوچک نشان می دهد که آبسه سیتوکینتیک نیاز به یک بسته اسپندل مرکزی در سلولهای پستانداران دارد ، در حالی که تکمیل خزیدن نیست.

• Kurasawa Y.
• Eashaw W. C.
• Mochizuki Y.
• Dohmae N.
• Todokoro K.

]. ما در اینجا نشان می دهیم که بیان PRC1 ، مونتاژ دوک نخ ریسی و مکانیسم های سیتوکینتیک در جنین های مهره داران اولیه تنظیم می شوند و حتی در بین انواع سلول های اپیتلیال مشتق از اکتودرم نیز متفاوت هستند. یک سؤال برجسته مربوط به نقش رشد چنین تقسیمات سلولی اصلاح شده است. این مکانیسم ها ممکن است مربوط به تخصص های میانه باشد. Midbody یک ساختار مبتنی بر میکروتوبول است که در نقطه آبشارهای نهایی تقسیم سلول ها تشکیل می شود [

• Saxton W. M.
• McIntosh J. R.

• Skop A. R.
• لیو اچ.
• Yates 3rd ، J.
• مایر B. J.
• Heald R.

• کریشان A.
• باک R. C.

• Bellairs R.
• Bancroft M.

• Bancroft M.
• Bellairs R.

تمایز صفحه عصبی و لوله عصبی در جنین جوجه جوانمطالعه با میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری

• دوبرویل V.
• Marzesco A. M.
• کوربیل دی.
• هاتنر دبلیو بی.
• ویلش-برانینگر ام.

میانه بدن و مژک اولیه پیش سازهای عصبی، ذرات غشای خارج سلولی غنی شده در نشانگر سلول های بنیادی پرومینین-1 را آزاد می کنند.

• Wilcock A. C.
• Swedlow J. R.
• طبقه K. G.

جهت گیری دوک میتوزی سلول های بنیادی و حالت های انتهایی تولید نورون را در نخاع اولیه متمایز می کند.

]. به عنوان مثال ، میکروتوبولهایی که فرآیندهای آپیکال سلولهای عصبی بالغ را تشکیل می دهند ، از قسمت میانی گرفته می شوند [

• Wilcock A. C.
• Swedlow J. R.
• طبقه K. G.

جهت گیری دوک میتوزی سلول های بنیادی و حالت های انتهایی تولید نورون را در نخاع اولیه متمایز می کند.

]. علاوه بر این، هنگامی که تقسیم کامل شد، بدنه های میانی سلول های عصبی می توانند از سطح سلول آپیکال به مجرای لوله عصبی رها شوند، رویدادی که در حفظ تعادل تقسیم های تکثیری و عصبی نقش دارد.

• دوبرویل V.
• Marzesco A. M.
• کوربیل دی.
• هاتنر دبلیو بی.
• ویلش-برانینگر ام.

میانه بدن و مژک اولیه پیش سازهای عصبی، ذرات غشای خارج سلولی غنی شده در نشانگر سلول های بنیادی پرومینین-1 را آزاد می کنند.

]. این رفتار به شدت با رفتار تقسیم سلول های HeLa که در آن قسمت میانی توسط یکی از دو سلول دختر حفظ می شود، در تضاد است.

• میشیما ام.
• کایتنا اس.
• Glotzer M.

مونتاژ دوک مرکزی و سیتوکینز نیاز به یک کمپلکس پروتئین/RhoGAP شبیه کینزین با فعالیت بسته بندی میکروتوبول دارد.

• گروملی آ.
• یامن سی.
• رزا جی.
• ردیک اس.
• چن سی. تی.
• میرابل اس.
• گوها ام.
• سیلیبورن جی.
• داکسی اس. جی.

لنگر انداختن سانتریولین مجتمع های اگزوسیست و SNARE در قسمت میانی بدن برای بریده شدن با واسطه وزیکول ترشحی مورد نیاز است.

]. مشابه آن سلول ها در لوله عصبی بسته، ما اغلب رها شدن اپیکال بادی های میانی را در فیلم های سلول های صفحه عصبی باز که MKLP1-GFP را بیان می کنند (فیلم S12) مشاهده کردیم. فیلم های tau-GFP و MKLP1-GFP همچنین نشان می دهند که طول عمر میانی بدن در سلول های عصبی اولیه در مقایسه با سلول های اپیدرمی به طور قابل توجهی طولانی تر شده است (شکل های 1F-1H؛ فیلم های S5 و S6؛ داده ها نشان داده نشده است). از بررسی جنین های ثابت در موش ها و جوجه ها نیز می توان دوام میانی بدن را استنباط کرد.

• Bancroft M.
• Bellairs R.

تمایز صفحه عصبی و لوله عصبی در جنین جوجه جوانمطالعه با میکروسکوپ الکترونی روبشی و عبوری

• کوهن ای.
• بینه اس.
• ماینینگر وی.

سیلیوژنز و تشکیل سانتریول در سیستم عصبی جنینی موشتحلیل فراساختاری

]. ما پیشنهاد می کنیم که تغییرات مشاهده شده در مکانیسم تقسیم سلولی در مطالعه حاضر ممکن است به مونتاژ مناسب این میان بادی های تخصصی که به صورت آپیکال قرار گرفته اند، مرتبط باشد.

در نتیجه، اگرچه مکانیسم های سیتوکینتیک در سلول های حیوانی به شدت حفظ شده اند، مطالعات تصویربرداری درون تنی گزارش شده در اینجا درجه شگفت انگیزی از انعطاف پذیری در سیستم را نشان می دهد. ما نشان می دهیم که این فرآیند اساسی حتی در میان جمعیت های سلولی مرتبط در همان ارگانیسم به طور چشمگیری متفاوت است. یافته های ما مبنی بر اینکه چنین پلاستیسیته ای را می توان در سطح PRC1 و دوک مرکزی ایجاد کرد، تنوع کمتری را در مکانیسم هایی که توسط آن ماشین آلات مولکولی که سیتوکینز را هدایت می کنند، برجسته می کند.

فرایندهای تجربی

انزوا و تزریق جنین

زنوپوس لائویس با 700 میلی لیتر هورمون گنادوتروپین کوریونی انسانی (HCG) تزریق شد و در دمای 18 درجه سانتیگراد یک شبه ذخیره شد. روز بعد ، تخمک ها از مادران جدا شده و بارور شدند. جنین ها با محلول 3 ٪ سیستین در 1/3 mmr dejellied شدند. جنین ها به مرحله چهار سلولی رشد کردند و با mRNA ها یا به دو سلول پشتی ، برای عصبی اولیه تزریق شدند. یا به کل جنین ، برای اواخر اپیدرم. mRNA ها با کیت mmessage (Ambion) ساخته شدند و به شرح زیر تزریق شدند: MEMBRANE-RFP ، 200 pg ؛H2B-GFP ، 200 pg ؛H2B-RFP ، 150 pg ؛و Tau-GFP ، 50 pg. PRC1-GFP-DNA انسانی با غلظت 200 pg به صورت خلفی تزریق شد.

تصویربرداری و تجزیه و تحلیل زمان

جنین ها با mRNA مناسب تزریق شدند و به مرحله صحیح رشد کردند - مرحله 13 برای عصبی اولیه و مرحله 30 برای اپیدرم اواخر - و برای میکروسکوپ کانفوکال آماده شدند (شکل S1). جنین های مرحله 13 در یک ظرف کشت پر از 2 ٪ آگارز با چاه های کوچک ساخته شده در آگارز با یک شانه مو کمی ذوب شده قرار گرفتند. جنین ها به گونه ای معکوس شدند که سطح پشتی (صفحه عصبی) با هدف روبرو شود. جنین های مرحله 30 در یک ظرف کشت قرار گرفتند و با پوشیدن 100 میکرولیتر از 0. 8 ٪ آگارز با ذوب پایین ، بی حرکت شدند.

تمام تصویربرداری با میکروسکوپ Zeiss LSM5 Pascal با اهداف 40 × Plaeofluar (1. 3 Na) یا 63 × Planapochromat (1. 4 NA) اهداف فرومایه انجام شد. برش های نوری کانفوکال جمع آوری شد و پیش بینی های حداکثر شدت با نرم افزار Zeiss LSM5 ساخته شد. اندازه گیری فاصله از فیلم های پیش بینی شده با تصویر Pro-Plus ساخته شده است. برای اهداف ارائه ، برخی از فیلم ها با Abode Photoshop پردازش شده اند. پارامترهای تصویربرداری و پردازش دقیق تر در داده های تکمیلی موجود است.

تجهیزات ایمنی

برای ایمن سازی MT (شکل 2 ، شکل 3) ، جنین ها به مراحل مناسب رشد داده و در 1 memfa 1 ثابت شدند [

• Sive H. L.
• گرینگر R. M.
• هارلند آر. ام.

] در 4 درجه سانتیگراد در طول شب. جنین ها به طور کامل در متانول 100٪ آبگیری شدند و یک شبه در دما ی-20 درجه سانتیگراد در متانول ذخیره شدند. سپس جنین ها در جعبه نور در 60 درصد متانول / 10 درصد H2O2 سفید شدند. آبگیری مجدد با شستشوهای 5 دقیقه ای انجام شد: ابتدا با متانول 50 درصد در TBS، سپس با متانول 25 درصد در TBST و در نهایت با 100 درصد TBST. سپس جنین ها به مدت 1 ساعت در 300 میکرولیتر TBS + 10٪ FBS + 5٪ DMSO مسدود شدند. آنتی بادی اولیه، رقت 1:250 برای موش ضد α-توبولین (سیگما)، به این مخلوط اضافه شد و جنین ها یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. جنین ها 5× در هر ساعت در TBST شسته شدند و مجدداً همانطور که در بالا توضیح داده شد مسدود شدند و آنتی بادی ثانویه رقت 1:200 برای anti-Mouse-alexa-488 اضافه شد. جنین ها دوباره در یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. محلول آنتی بادی ثانویه دور ریخته شد و جنین ها 5×1 ساعت در TBST شسته شدند. در برخی موارد، در آخرین شستشو رقت 1:2000 پروپیدیوم یدید به هسته های برچسب اضافه شد.

برای رنگ آمیزی ایمنی دوک مرکزی و پروتئین های مسافری (شکل 4؛ شکل های S3 و S4)، جنین ها در مراحل مناسب رشد کردند و در Dent's Fix (80% متانول / 20% DMSO) ثابت شدند.

• بکر بی. ای.
• Gard D. L.

تجسم اسکلت سلولی در تخمک ها و تخمک های Xenopus با میکروسکوپ ایمونوفلورسانس کانفوکال.

] یک شب در 4 درجه سانتیگراد. جنین ها به طور کامل در متانول آبگیری شدند و در دمای 20- درجه سانتیگراد یک شبه نگهداری شدند. جنین ها به آرامی با شستشوی 5 دقیقه در متانول 75 درصد در H2O، 50 درصد متانول در PTW، متانول 25 درصد در PTW و در نهایت PTW هیدراته شدند. جنین ها در جعبه نور در محلول 0. 33% H2O2، 0. 5% فرمامید و 2. 5% 2× SCC سفید شدند. سپس جنین ها سه بار در TBST و هر بار به مدت 5 دقیقه شسته شدند. جنین ها در 300 میکرولیتر TBS + 10٪ FBS + 5٪ DMSO مسدود شدند. آنتی بادی اولیه اضافه شد. rabbit-anti-PRC1 1:20 (BioLegend), rabbit-anti-MKLP1 1:200 [